Nach dem Tode von Graf Enno II 1540, der die Ausbreitung der Reformation wie sein Vater Edzard (d. Gr.) gefördert hatte, wurde in der vormundschaftlichen Regierungszeit seiner Witwe, der Gräfin Anna, von 1540 - 1561deutlich, in welchem Glaubens-Dilemma sich das Land inzwischen befand. Mit den Flüchtlingen aus den Niederlanden durch die spanischen Befreiungskriege, kamen die verschiedensten Glaubensrichtungen in das neutrale Ostfriesland. Darunter die von Menno Simons (Menoiten), die Wiedertäufer und vor allem die der Calvinisten (Reformierte).

Von Annas 3 Söhnen bekannte sich Edzard II zur lutherischen und Christoph und Johann zur calvinistischen Glaubensrichtung.

Vielleicht lag der Grund für die Abschaffung der Primogenitur durch die Gräfin darin, dass sie somit nach der Heirat ihres ältestgeborenen Sohnes Edzard II mit der schwedischen Königstochter Katharina, die Einführung einer lutherischen Landeskirche verhindern wollte. So entschied sie, dass ihre Söhne Edzard II, Christoph und Johann ab 1561 gemeinsam regieren sollten. 

Nachdem Christoph bereits im Türkenkrieg von 1566 gefallen war, stritten die beiden anderen verbittert um die Vormachtstellung im Lande. Dabei zeigte sich, dass die östlichen Gebiete der Grafschaft die lutherische Glaubensrichtung bevorzugten. 

Der westliche Teil mit Emden war überwiegend calvinistisch. Daraufhin setzte Gräfin Anna 1543 den polnischen Adeligen Johannes Laski, der sich lateinisch a Lasco nannte, als ersten reformierten Superintendenten ein. Diesem gingen die lutherischen Reformen nicht weit genug. Er setzte in Emden einen calvinistischen Kirchenrat ein und verfasste den "Emder Katechismus".

A Lasco, der bei seiner Einführung auch die Verbrennung von Hexen durchsetzte, musste schon 1548 nach dem Sieg von Kaiser Karl V über den "Schmalkaldischen Bund" (mit dem die Reformation zurückgedrängt werden sollte) wieder das Land verlassen.

In der Folgezeit erlebten die ostfriesischen Stände durch ständig neue Geldforderungen des Grafenhauses eine echte Bewährungsprobe. Dazu verschärfte sich der glaubensbedingte Streit  der Grafen so sehr, dass 1589 der Kaiser angerufen wurde, damit der Wiener Reichshofrat die Ordnung im Lande wieder herstellen möge.

Auf Wunsch der Stände wurde in dem Dekret die Bildung eines Hofgerichts als höchste richterliche Instanz veranlasst. Dieses Gericht wurde 1593 auch eröffnet. Die Benennung der Richter von den erfolgte durch die Stände, die damit den Rechtsprechungsanspruch des Grafen umgingen..

Auch nach dem Tode des Grafen Johann im Jahre 1591 war Edzard II der einzige Regent von Ostfriesland. Trotzdem gab es keine Ruhe. Denn nun war der reformierte Prediger in der Großen Kirche in Emden, Menso Alting, sein Widersacher. Er mauserte sich zum heimlichen Herrscher der Stadt. Dabei wiegelte er die Bürgerschaft gegen den von Edzard eingesetzten Rat mit der Folge auf, dass diese in der s. g. "Emder Revolution" von 1595 den Rat absetzten und Edzard II zum Verlassen der der Burg und der Stadt aufforderten.

Edzard verlegte daraufhin seine Residenz nach Aurich. Die Vorgänge in Emden geschahen mit Unterstützung der Niederländer, die zuvor die Spanier 1594 aus Groningen vertrieben hatten. Sie schickten auch eine Schutztruppe nach Emden.

In dem Vertrag von Delftsiel vom 15. Juli 1595 musste Edzard auf seine alten Rechte in der Stadt Emden verzichten. Durch den Schutz der Holländer, der bis 1744 anhielt, hatte Emden einen ähnlichen Status wie eine freie Reichsstadt.

In dem übrigen Ostfriesland nahmen die Glaubensstreitigkeiten weiter an Schärfe zu. Da wurde z. B. der calvinistische Ubbo Emmius aus dem lutherischen Norden vertrieben und das gleiche Schicksal erlitt 1595 der lutherische Pastor Hermann Conring aus Hinte.

1599 wurde schließlich in dem ostfriesischen Landtag die Religionsteilung des Landes beschlossen.

In den farbig dargestellten Konfessionsbereichen in den Ämtern und Herrlichkeiten gab es auch vereinzelte Orte, die anderen Glaubens waren. Die Insel Borkum war z. B. reformiert.

Der Glaubenszwist führte auch dazu, dass in den westlichen Landesteilen holländisch gepredigt und teilweise gesprochen wurde. In dem s. g. Apellekrieg über den später berichtet wird, kam es sogar zu Schießereien.

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